RNA斑点杂交实验方案

       RNA斑点杂交是一种类似于Northern印迹的技术；然而，RNA样品不能通过电泳分离，需要用膜去成像。

所需材料

试剂：

        - RNA样本

        - 不含RNase水

        - TBST（1×TBS，0.1% Tween-20）

        - 封闭液

        - 一抗

        - 二抗（山羊抗兔 IgG-HRP 或山羊抗小鼠 IgG-HRP）

        - ECL底物

        - 链霉亲和素-AlexaFluor®488

        - 亚甲蓝染色缓冲液（0.4 M乙酸钠和0.4 M乙酸中添加0.2%的亚甲基蓝）

设备：

        - 不含RNase管

        - 加热板

        - 带正电的尼龙膜

        - 10厘米塑料培养皿

        - 紫外交联仪SG Linker（带254 nm灯泡）

        - 成像系统

实验步骤

1 .从冰箱中取出RNA样本（分装）。解冻RNA样本管后放回冰上。

2.使用不含RNase的试管，用不含RNase的水逐级稀释RNA样本。

        2.1可参考最终浓度：2.5/0.25/0.025/0.0025 μg/μL。

        2.2我们将含有RNA修饰的正寡核苷酸和不含修饰的负寡核苷酸稀释为50 ng/μL和5 ng/μL。

3.将连续稀释的RNA在加热块中以95°C的温度孵育3分钟，以破坏二级结构。

4.变性后立即将试管放在冰上冷却，以防止RNA二级结构的重新形成。

5.将带正电的尼龙膜剪成合适的尺寸，需要足够大以容纳2×4的网格。

        5.1用铅笔在膜上轻轻标记网格，辅助加样。

        5.2将膜转移到干净的10厘米塑料培养皿中。

6 .用移液器上下吹打混匀RNA样本。将2 µL RNA滴到膜上。

        注意：避免用移液器枪头接触膜。让移取的RNA液滴通过表面张力扩散到膜上。每次上样后更换枪头，包括同一样本之间不同批次取样。

7 .立即将装有膜的培养皿转移到紫外交联仪SG Linker的腔室中。

        7.1取下培养皿盖，确保膜的RNA面朝上。

        7.2用紫外线将RNA交联到膜上：254 nm照射30 min-1 h。

8.用10 mL TBST（1×TBS、0.1% Tween-20）清洗膜，室温下清洗5分钟，轻轻摇晃以洗掉未结合的RNA。

9.将膜（RNA面朝下，以防止膜意外变干）放入10 ml封闭缓冲液中，室温下轻轻摇动孵育1小时。

10.弃去封闭缓冲液，将膜与一抗（按给定稀释度，通常为1 μg/mL工作IgG）在 10 ml封闭缓冲液中孵育，4°C下轻轻摇动孵育过夜。

11.将膜翻转，使RNA面朝上。让膜在10 mL TBST中轻轻摇晃清洗三次，每次10分钟。

12 .将膜翻转，使RNA面朝下。室温下，将膜与适当的二抗（山羊抗兔 IgG-HRP或抗鼠 IgG-HRP）在封闭缓冲液中轻轻摇动孵育1小时。

13 .将膜翻转，使RNA面朝上。将膜在10 mL TBST中轻轻摇晃清洗四次，每次 10 分钟。

14.将膜与ECL底物一起孵育5分钟。

15.使用成像系统曝光膜。以高分辨率模式拍摄图像，曝光时间为1秒至3分钟，间隔适当。曝光后，用TBST清洗膜10分钟。

        注意：1）如果寡核苷酸是生物素化的，则使用Streptavidin-AlexaFluor®作为上样对照进行探测。

        2）确保先前成像的ECL已被淬灭；

        3）尽量清洗彻底，降低背景。

16 .将膜与Streptavidin-AlexaFluor®488（TBST中）一起在黑盒中孵育1小时。

17 .将膜转移到成像系统。使用Alexa 488荧光模式拍摄图像。

18 .荧光成像后，将膜转移到含有10 mL亚甲基蓝染色缓冲液中（0.2%亚甲蓝，0.4 M醋酸钠和0.4 M醋酸）。孵育30分钟，并轻轻摇动。

        提示：对于非生物素化RNA的上样控制，可以使用亚甲蓝或溴化乙锭。

19 .用dH2O清洗膜，直到背景干净（大约30秒至60秒）。

20 .使用成像系统对亚甲基蓝染色膜进行成像。

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