胞壁酶(Zymolyase)实验方案

胞壁酶(Zymolyase)实验方案

1.在3 mL选择性培养基中培养细胞过夜。

2.用微量离心机快速离心两次，收集细胞沉淀。

3.将细胞重悬于200 μL以下溶液中：

• 5 mL SCE*
• 60 μL 10 mg/mL 100T 胞壁酶(Zymolyase)
• 10 μL 2-ME（M755744）

4.涡旋混匀，37 °C孵育30–60分钟。

5.加入400 μL 0.2 N NaOH/1% SDS（S767322），轻轻倒转混匀，在冰上孵育5分钟。

6.加入300 μL 3 M K/5 M醋酸钾（P108329），pH 4.5，轻轻倒转混匀，在冰上孵育5分钟。

7.在微量离心机中离心2分钟，将上清倒入新的离心管中，再次离心。取500 μL上清到新的离心管。

8.加入300 μL异丙醇（I112021），涡旋混匀，室温静置5分钟。

9.在微量离心机中离心5分钟收集DNA沉淀，用70%乙醇（E111992）洗涤沉淀并再次离心。

10.在真空浓缩仪中干燥沉淀，并用25 μL TE缓冲液（T476214）重悬。

11.取2 μL样品转入电转感受态大肠杆菌，复苏后全部平板培养。

*SCE缓冲液配方：

1 M山梨醇（D755727）

0.1 M枸橼酸钠（S189183），pH 7.6

0.06 M EDTA（E278775）

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酵母转化方法与试剂

引言：

         酵母转化可通过多种方法实现，其中锂离子处理法和原生质体融合法应用最为广泛。这些方法在转化效率上差异显著，不同试剂的使用亦会影响结果。例如，在原生质体转化中，聚乙二醇（PEG）的质量对DNA摄取效率至关重要，其批次检测方式类似于细胞培养中对血清质量的评估。本研究比较了锂离子法与原生质体融合法的转化效果，并在原生质体转化中评估了Zymolyase和Lyticase作为细胞壁降解酶的差异。

材料与方法：

• 酵母菌株

         所有转化实验均使用来自Invitrogen的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVSc1。该酵母的表型为MAT his3(Δ)1 leu2 trp1-289 ura3-52。转化实验利用其leu表型，通过LEU2互补选择转化子。

• 质粒DNA

         转化实验使用质粒YEp351/A/M作为对照DNA。该质粒含有LEU2，可实现亮氨酸互补，从而选择转化子。同时，该质粒携带一种易于检测的标记基因，用于验证。质粒包含ADC1启动子与MEL1编码区的融合，这使得MEL1在葡萄糖环境中表达，并合成β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）。β-半乳糖苷酶可通过多种比色底物检测，例如利用X-β-Gal的酶促切割反应。

1.锂离子法转化酿酒酵母（Lithium Cation Method）

材料

• YPD液体培养基（Y778413）
• TE缓冲液（T476214）
• 100 mM醋酸锂（L102778，溶于TE缓冲液，灭菌）
• 质粒DNA
• 50%PEG 4000（P615468，水溶液，灭菌）
• 1 M山梨醇（D755727，溶于TE缓冲液）
• Leu选择性琼脂平板：1%葡萄糖（D755713）、0.67%酵母氮源（Y110517）、1 M山梨醇（D755727）

操作步骤

12.在YPD液体培养基中（2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物）于30°C振荡培养过夜（有充气通气）。培养液的细胞密度应约为1×10^7个细胞/mL。

13.每次转化取4.5 mL培养液，在3000 rpm离心5分钟收集酵母沉淀。

14.将酵母重悬于4 mL TE缓冲液中，再次3000 rpm离心5分钟。

15.小心将酵母重悬于3 mL 100 mM醋酸锂/TE缓冲液中，室温轻轻摇动30分钟。

16.以2000 rpm离心5分钟，小心移除上清，将酵母重悬于100 μL醋酸锂/TE溶液中，并转移至1.5 mL微量离心管。此时酵母的最终密度约为5×10^8个细胞/mL。

17.向酵母悬液中加入不超过10 μg质粒DNA（总体积不超过10 μL），在30°C静置孵育30分钟。

18.加入300 μL 50% PEG溶液，混匀后在30°C静置孵育1小时（不摇动）。

19.在42°C热激5分钟。

20.立即离心20秒，小心移除PEG溶液，将细胞重悬于1 mL山梨醇/TE溶液中。

21.将细胞涂布于选择性培养基平板，待平板表面干燥后倒置培养。

2.原生质体法转化酿酒酵母（Protoplast Method）

材料

• 1 M山梨醇（D755727）、25 mM EDTA（E278775）、pH 8 50 mM DTT（D104859），山梨醇/EDTA溶液单独配制并灭菌，分子生物学级的1 M DTT储液（无菌过滤）分装成500 μL，冷冻保存使用前将DTT加入9.5 mL山梨醇/EDTA溶液中
• 1 M山梨醇（高压灭菌）
• 1 M山梨醇、1 mM EDTA、10 mM枸橼酸钠缓冲液（S189183），pH 5.8（用于Zymolyase）
• 1 M山梨醇、1 mM EDTA、10 mM Tris缓冲液（T755536），pH 7.5（用于Lyticase）
• Zymolyase（溶于水），60 U/mL
• Lyticase（L303583，溶于水），1200 U/mL
• 1 M山梨醇、10 mM Tris，pH 7.5、10 mM CaCl₂（C431202）
• 20% PEG（P615468）/10 mM Tris，pH 7.5、10 mM CaCl₂（现配）
• Leu选择性琼脂平板：1%葡萄糖（D755713）、0.67%酵母氮源（Y110517）、1 M山梨醇（D755727）
• Leu选择性顶层琼脂管：10 mL 1%葡萄糖、0.67%酵母氮源、1 M山梨醇，装于带泡沫塞的大试管中；使用时熔化并保持47°C
• 无菌分子生物学级水（W119420）
• 5%SDS（S767322，水溶液）

操作步骤

1.将冷冻保存的酵母划线接种于YPD琼脂平板（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂），在28–30°C培养24–48小时。

2.从单个菌落接种到100 mL YPD液体培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖），置于500 mL三角瓶中，在28°C、250–300 rpm振荡培养过夜。

3.次日测定培养液OD₅₂₀（用无菌YPD归零分光光度计）。如需，可稀释至0.1–1.0范围内可读OD。

• 若OD在0.2–0.3之间，则直接收集细胞。
• 或稀释至OD0.2继续培养，至OD0.3时，于室温1500×g离心10分钟收集细胞沉淀。

4.将细胞沉淀彻底重悬于10 mL无菌水中，转入无菌15 mL螺口管。

5.室温1500×g离心5分钟，弃上清，保留细胞沉淀。

6.将酵母重悬于10 mL新配的1 M山梨醇、25 mM EDTA、pH 8、50 mM DTT中，室温1500×g离心5分钟。

7.将细胞重悬于10 mL 1 M山梨醇中，室温1500×g离心5分钟。

8.将细胞重悬于10 mL山梨醇/枸橼酸缓冲液（1 M山梨醇、1 mM EDTA、10 mM枸橼酸钠缓冲液，pH 5.8），取1.6 mL细胞悬液加入2.5 mL Zymolyase，用于检测原生质体形成时间与效率；其余细胞保留。

9.将细胞重悬于10 mL山梨醇/Tris缓冲液（1 M山梨醇、1 mM EDTA、10 mM Tris，pH 7.5），取1.6 mL细胞悬液加入2.5 mL Lyticase，用于检测原生质体形成时间与效率；其余细胞保留。

10.加入细胞壁裂解酶（Zymolyase或Lyticase）后，于30°C孵育，分别在0、5、10、20、30、40、50、60分钟取200 μL样品至2 mL 1 M山梨醇中，再加入800 μL 5% SDS，混匀，测定OD₈₀₀以评估细胞裂解情况（以1 M山梨醇为空白对照）。

11.绘制OD₈₀₀–时间曲线，计算原生质体形成效率：效率=（各时间点OD₈₀₀/初始OD₈₀₀）×100；达到70%原生质体效率即可进行转化。

12.对剩余细胞加入13 mL Lyticase或Zymolyase，按测得时间孵育至70%原生质体效率。注意轻柔操作，避免原生质体破裂。

13.室温750×g离心10分钟，弃上清，保留沉淀。

14.将原生质体轻柔重悬于1 mL 1 M山梨醇中，室温750×g离心。

15.将原生质体重悬于5 mL 1 M山梨醇、10 mM Tris（pH 7.5）、10 mM CaCl₂中，离心后重悬于300 μL同组成溶液中。

16.每次转化取100 μL原生质体于无菌15 mL离心管中，加入10 μg YEp351/A/M对照质粒，室温孵育10分钟。

17.加入1.0 mL新配的20% PEG / 10 mM Tris（pH 7.5）、10 mM CaCl₂，轻柔混匀，室温孵育10分钟。

18.室温750×g离心10分钟，小心弃去PEG溶液，倒置试管沥干多余液体。

19.将原生质体轻柔重悬于1 mL 1 M山梨醇中。

20.取100 μL原生质体加入10 mL熔化的顶层琼脂中，倒在选择性平板上，待其凝固。

21.倒置平板，在28–30°C培养，4–6天可见转化菌落。

结果与讨论：

采用YEp351/A/M对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的转化获得了成功。转化效率受方法和裂解酶种类显著影响。原生质体转化法的效率（Zymolyase：652个转化子/10 µg质粒；Lyticase：53个转化子/10 µg质粒）远高于锂离子转化法（6个转化子/10 µg质粒）。原生质体转化虽效率高，但需去除并再生细胞壁，操作难度和成本较高；锂乙酸盐法则简便，但效率较低。

裂解酶差异是原生质体转化效率变化的主要原因。Zymolyase由多种碳水化合物水解酶（如β-1,3-葡聚糖五糖水解酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶和甘露糖苷酶等）组成，能协同降解细胞壁，在形成约70%原生质体的同时保留足够的细胞壁结构以利再生。相比之下，Lyticase降解特异性有限，可能导致细胞壁去除不足或过度，进而降低融合与再生效率。

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