RNA提取和反转录实验方案

        RNA提取和反转录实验是分子生物学中用于研究基因表达和功能的关键技术。RNA提取是从细胞或组织中分离出完整、无杂质的RNA，而逆转录则是将RNA转化为cDNA，以便用于后续的PCR扩增或测序分析。

         这一实验流程在基因表达分析、疾病诊断、药物研发、基因功能研究以及农业生物技术等领域具有重要价值，能够帮助科学家深入理解基因不同在生理和病理条件下的表达模式和调控机制，为生命科学研究和医学应用提供重要支持。

第 1 阶段   细胞RNA提取

步骤

1.细胞收集：使用至少10⁶个细胞，吸出培养基，用1-2 mL冷PBS洗涤一次。

2.加入TRIzol：吸出PBS后加入1 mL TRIzol，轻轻刮擦检测板，使细胞完全裂解，将TRIzol/细胞裂解液转移至1.5 mL离心管中。

3.静置与分层：室温静置5分钟，加入250 µL氯仿，剧烈振摇15秒，室温静置5分钟。

4.离心：以12,000 × g的速度离心15分钟，离心管中会出现三层：上层透明水相（含RNA）、中层白色沉淀（DNA）、底层粉色有机相。

5.提取RNA：小心移取上层水相至另一离心管，加入550 µL异丙醇，轻轻混匀，室温静置5分钟。

         注意留下一些水相（高于DNA层约1毫米，以防止DNA污染）。

6.沉淀RNA：以最大速度（~12,000 × g）离心20分钟（收率低时可离心30分钟），倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇，以11,500 × g的速度离心5分钟。

7.干燥与溶解：倒掉乙醇，晾干沉淀物（避免过度干燥或乙醇残留）。当沉淀物周围仅剩下极小的溶液弯月面时，加入15-25 µL DEPC处理的TE缓冲液或DEPC处理水溶解RNA。

         这是关键的一步；如果沉淀物干燥过度，RNA就会结晶，很难重新溶解。如果乙醇蒸发不足，也会阻止RNA进入溶液。

8.将RNA按照1:40的比例稀释（1.2 µl RNA加入48.8 µl TE缓冲液中）至小EP管中，然后添加到微量比色皿中。然后测量260 nm处的吸光度。

         260/280比率应大于1.8。如果小于1.5 - 1.6左右，则RNA可能至少部分降解。较低的比率也表明存在DNA或硫氰酸盐污染。RNA浓度（以µg/µl为单位）基本上相当于260 nm处的OD。

第 2 阶段   DNase处理

步骤

1.制备DNase混合液：每份样本包含1 µL RQ1不含RNase的DNase、2 µL DNase 10× 反应缓冲液、6 µL DEPC处理水和0.5 µL RNase Out。

2.处理RNA：向离心管中加入2 µg RNA（根据前一阶段测定的RNA的浓度来计算体积），用DEPC处理水调整总体积至11 µL，加入9 µL DNase预混液，总体积达到20 µL。

3.孵育：使用热循环仪，将样品在37°C孵育15分钟，65°C孵育20分钟，然后放置冰上。

4.离心：将每个样品短暂离心，确保样本集中在试管底部，RNA即可用于逆转录。

第 3 阶段   RNA反转录

         大多数情况下，每份RNA样本（1 µg，或来自DNase处理反应的10 µl）将用反转录酶运行，第二个1 µg等分试样用于无RT对照。

步骤

1.准备反应体系：每份样本混合以下试剂（总量应为 56 µl），涡旋混匀：

         - 13 µl DEPC处理水

         - 16 µl 5× 第一链缓冲液

         - 7 µl DTT（0.1 M）

         - 8 µl 随机引物（浓度= 0.1 µg/µl或3 µg/µl按照1/30稀释度稀释）

         - 8 µl 牛血清白蛋白

         - 3 µl dNTPs

         - 1 µl RNase Out

2.分装与反应：将56 µL预混液分装到两个离心管，一个用于RT反应（加入2 µL MMLV逆转录酶），另一个用于无RT对照（加入2 µL H₂O），每个离心管加入10 µL DNase处理的RNA，移液器吹打，混匀。

3.孵育与失活：将所有样品在37°C孵育1小时，然后在95°C孵育5分钟使酶失活。

4.立即用于PCR或-20°C保存备用。

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