多重免疫组化实验方案

         多重免疫组化（mIHC）是一种基于酪胺信号放大（TSA）技术的原位多重标记方法，可在单张组织切片上实现多靶点（通常6-8种）的同步检测。其核心原理是通过HRP催化荧光酪胺底物共价结合靶抗原，再通过热修复或抗体洗脱液去除非共价结合的抗体复合物，逐轮更换抗体和荧光染料完成多轮标记。该技术广泛应用于肿瘤微环境分析、免疫细胞空间定位、药物靶点评估等领域。

实验步骤

1. 样本准备

石蜡切片脱蜡水合

1.1将切片浸入二甲苯中，重复三次，每次10分钟，去除切片中的石蜡。

1.2切片放入无水乙醇中，重复两次，每次10分钟。

1.3依次放入梯度乙醇浸泡（95%、85%、75%），各10分钟。

1.4用dH2O清洗切片，重复两次，每次5分钟。

          用量：每步骤浸没切片，液体体积需覆盖组织（约50-100 mL/玻片）。

冰冻切片/细胞爬片处理

1.1将切片/爬片浸泡于4%多聚甲醛10-30分钟，进行固定。

1.2浸泡于0.3% Triton X-100，透膜20分钟。

1.3用PBS冲洗3次，每次5分钟。

2. 抗原修复

微波修复

2.1使用一个微波炉，并将载玻片放入 pH 6.0 10 mM 柠檬酸钠缓冲液（柠檬酸三钠2.94 g/L或EDTA 0.37 g/L + Tris 1.21 g/L）高火至煮沸。

2.2停火，使玻片在余温下保持10分钟。

2.3中低火继续加热维持7分钟（注意补液，防止蒸发过度导致干片）。

2.4取出载玻片，放置在台上冷却到室温，维持30分钟。开放蛋白质的抗原表位，使抗体更容易与目标抗原结合，提高染色效果。

高压修复

          100℃水煮15分钟或水浴20分钟。

3. 封闭内源性过氧化物酶

3.1用 dH2O 清洗切片3次，每次5分钟。

3.2将切片浸泡到3% 过氧化氢水溶液中，室温避光孵育15分钟，封闭内源性过氧化物酶。

3.3用1×TBST 洗涤切片3次，每次5分钟。

3.4切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），添加3% BSA或正常山羊血清均匀覆盖在组织上，室温封闭30分钟。

4. 抗体孵育

4.1配置一抗稀释液，并根据抗体的推荐稀释度，对一抗进行稀释。

4.2向切片样品处添加稀释好的一抗，通常每个切片添加 100-400 μl，然后将切片放于加湿箱中4℃过夜或室温孵育1-2小时。

4.3清除一抗溶液，并用1×TBST 轻轻冲洗3次，每次5分钟。

4.4往切片组织上滴加几滴多聚HRP标记二抗的稀释液，置于加湿箱中室温避光孵育1小时。

4.5清除二抗溶液，并用1×TBST 轻轻冲洗3次，每次5分钟，注意避光。

5. TSA荧光染料反应

5.1根据靶标的表达水平，选择合适的荧光团偶联的TSA试剂。

5.2根据TSA试剂的推荐浓度，对试剂进行稀释；

5.3往往切片组织上滴加100-400 μl 稀释的TSA试剂，置于加湿箱中室温避光孵育5-10分钟，注意避光。

5.4用1×TBST 轻轻冲洗3次，每次5分钟，避光。

6. 重复染色（多轮标记）

          如果要检测多个目的靶标进行多重染色，可直接跳转到步骤7进行抗体剥离并重新染色；

          如果已完成多重检测染色或正在进行单重检测，可直接到步骤8进行封片。

          多轮标记时，每轮更换一抗和TSA染料（不同激发波长）。推荐染色顺序：低丰度靶标→高丰度靶标，弱荧光染料→强荧光染料。

7. 抗体剥离

7.1对石蜡切片，使用预热的抗原修复液，100℃水浴25-40分钟。

对冰冻/细胞样本，使用mIHC专用洗脱液，37℃处理5-20分钟，重复两次。

7.2洗脱后PBS冲洗3次，每次5分钟。

8. DAPI复染与封片

8.1往切片上滴加DAPI染液，室温避光孵育10分钟。

8.2用1×TBST buffer 浸洗玻片3次，每次室温放置3 min。

8.3用移液器在玻片上滴加抗淬灭封片剂，确保浸没样本区域。

8.4盖上盖玻片，用指甲油密封玻片边缘，避光保存或直接用于镜检观察。

关键注意事项

（1）抗体优化：需通过单标预实验确定一抗浓度和TSA染料曝光时间（推荐曝光时间50-200 ms，通道间差异≤10倍）。

（2）洗脱控制：洗脱不足会导致残留信号干扰，过度洗脱可能破坏抗原。

（3）自发荧光处理：通过光谱成像记录组织自发荧光波长，避免与目标信号重叠。

（4）实验设计需结合靶标表达丰度、抗体亲和力及荧光染料光谱特性，建议参考文献中的优化案例。

如需了解更多产品详情，请前往阿拉丁官网查询。

https://www.aladdin-e.com