免疫肽封闭实验

        抗体有时可能会与抗原以外的蛋白质发生非特异性结合。这种情况通常更常见于多克隆抗体，但也可能出现在单克隆抗体中。

        为了确定哪个条带或染色是特异性的，可以进行免疫肽封闭实验。在进行染色方案之前，抗体被中和（与抗体识别的表位相对应的过量肽孵育）。与封闭肽结合的抗体不再可与蛋白质印迹中或细胞内存在的蛋白质表位结合。​

        然后将中和抗体与单独抗体一起使用，并比较结果。通过比较封闭抗体与单独抗体的染色，您可以看到哪种染色是特异性的；这种染色在使用中和抗体进行的蛋白质印迹或免疫染色中不会出现。

材料和试剂

        - 封闭缓冲液（通常为TBST加5%脱脂奶粉或3% BSA（用于蛋白质印迹法）或PBS加1% BSA（用于IHC）

        - 抗体封闭（免疫）肽

        - 两个管子

        - 两个相同的样本（例如，具有两个相同泳道的蛋白质印迹，切成两半；两张含有感兴趣细胞的载玻片；等等）

实验步骤

1.确定最佳浓度。

        1.1确定在特定方案中始终产生阳性结果的抗体最佳浓度。

        1.2使用该浓度，确定两次实验所需的抗体量。

        例如，如果在蛋白质印迹法中成功使用浓度为0.5 µg/mL的抗体。要使用2 mL抗体溶液对一条蛋白质印迹法进行染色，您需要在2 mL缓冲液中使用1 µg抗体。

2.稀释适量抗体。

        2.1将必要量的抗体在封闭缓冲液中稀释至两个实验所需的最终体积。

        2.2将其等量分入两个试管中。在第一个标记为“封闭”的试管中，按重量添加比抗体多五倍的封闭肽（本例中2 mL缓冲液中总肽量为 5 µg）。在第二个标记为“对照”的试管中，添加等量的缓冲液。

3.将两个试管在室温下搅拌孵育30分钟，或在4°C下孵育过夜。

4.染色。对两个相同的样本进行染色方案，其中一个样本使用封闭抗体，另一个样本作为对照。

5.观察染色情况。使用封闭抗体时消失的染色是该抗体特有的。

        提示：如果在蛋白质印迹实验中，由于肽/抗原竞争而出现一条以上的带消失，则这些带含有抗原决定簇，可能是完整抗原的片段，也可能是含有抗原的复合物。

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