免疫组织化学染色的抗原修复方案

       大多数福尔马林固定的组织在免疫组织化学染色之前需要抗原修复步骤。固定过程中形成的亚甲基桥交联蛋白质并掩盖抗原位点。抗原修复方法会破坏这些亚甲基桥并暴露抗原位点，从而使抗体能够结合。抗原修复的两种方法是热诱导表位修复（HIER）和酶修复。

        除非抗体数据表上注明了抗原修复方法，否则必须通过实验找到每种抗原的最佳方法。这也适用于热介导修复所用缓冲液的选择。我们建议测试多种方法以找到提供最佳染色的检索方法。

一、热诱导表位修复（HIER）

       热诱导表位修复通常使用高压锅、微波炉或蒸锅进行。一些实验室使用设置为60°C的水浴，并将载玻片在修复溶液中孵育过夜。对于处理在较高温度下加热时从载玻片上脱落的组织切片时，这非常有用，尤其是骨骼、软骨和皮肤组织。

1）热诱导表位修复：高压锅法

        在此过程中，载玻片应放置在金属架中。建议进行对照实验以优化检索时间，其中在免疫组织化学染色之前分别检索相同组织切片的载玻片 1、2、3、4 和 5分钟。

所需材料

        -家用不锈钢高压锅

        -热板

        -带载玻片架的容器，可容纳约400 - 500 mL

        -抗原修复缓冲液（Tris/EDTA pH9.0、柠檬酸钠pH6.0或其他）

实验步骤

1 .将适当的抗原修复缓冲液添加到高压锅中。

        1.1将高压锅放在电炉上，并打开全功率。

        1.2等待高压锅沸腾时，对切片进行脱蜡和再水化。

        警告：此时不要盖上高压锅的盖子，只需将其放在上面即可。

2 .煮沸后，将载玻片从自来水转移到高压锅中。

        警告：使用镊子转移。

3 .按照制造商的说明盖上高压锅盖。

4 .高压锅达到全压后，再加热3分钟。

5 . 3分钟后，关闭加热板并将高压锅放入空水槽中。

6 .启动压力释放阀并用冷水流过高压锅。

        减压后，打开盖子，将冷水注入高压锅中，煮10分钟。

        警告：小心热溶液。

        提示：这可以使载玻片冷却，以致抗原位点在暴露于高温后重新形成。

7 .继续免疫组织化学染色方案。

2）热诱导表位修复：微波法

        不建议使用家用微波炉，容易导致抗原修复不均匀。由于缺乏加压环境，抗原修复时间通常较长，几乎总是导致切片解离。实验室专用微波炉更合适。大多数品牌都有机载压力容器，可以将温度恒定在98°C，以避免切片解离。

        使用此方法时，缓冲液可能会溢出，大量修复缓冲液会蒸发。请务必注意载玻片容器的缓冲液水平，并在必要时添加更多缓冲液，不要让载玻片变干。

        注：在此过程中，载玻片应放置在塑料架和容器中。标准玻璃组织学染色架和器皿在加热时会破裂。

所需材料

        -实验室专用微波炉或家用微波炉（850 W）

        -带滑动架的微波炉容器，可容纳约400 - 500毫升或Coplins 罐

        -抗原修复缓冲液（例如Tris/EDTA pH 9.0、柠檬酸钠pH 6.0等）

实验步骤

1.对切片进行脱蜡和水化。

        注意：使用足够量的抗原修复溶液覆盖载玻片至少几厘米。

2.将适当的抗原修复缓冲液加入可微波加热的容器中。

        警告：务必监测蒸发情况，并注意操作过程中是否沸腾。不要让载玻片变干。

        注意：使用非密封容器，以便在煮沸过程中蒸发。

3 .将载玻片放入微波炉容器中。

        3.1将容器放入微波炉内。

        3.2如果使用家用微波炉，请将其设置为全功率并等待溶液沸腾。从此时开始煮20分钟。

        3.3如果使用实验室专用微波炉，请进行设置，以便在温度达到98°C后20分钟恢复抗原。

        警告：在操作过程中一定要监测蒸发情况并注意沸腾情况，并且不要让载玻片变干。

        注意：使用非密封容器以便在煮沸过程中蒸发。

4. 20分钟后，取出容器，用冷自来水冲洗10分钟。

        警告：小心热溶液。

        注意：这可以使载玻片充分冷却以便进行处理，并允许抗原位点在暴露于高温后重新形成。

5.继续免疫组织化学染色方案。

3）热诱导表位修复：蒸菜机法

       许多实验室使用蔬菜蒸锅或电饭锅进行热介导抗原修复。该过程类似于微波，因为它将缓冲液的温度保持在100°C，但没有微波方法的剧烈沸腾。此方法可以改为使用设置为100°C的水浴代替蒸锅。在此过程中，应将载玻片放在塑料或金属架和容器中。标准玻璃组织学染色架和容器在加热时会破裂。

所需材料

        -蔬菜蒸锅

        -带载玻片架的容器可容纳约400 - 500毫升（如果使用Tissue-Tek容器则为 250 毫升）

        -抗原修复缓冲液（例如 Tris/EDTA pH 9.0、柠檬酸钠 pH 6.0）

实验步骤

1 .对切片进行脱蜡和再水化。

        注意：使用足够体积的抗原修复溶液覆盖载玻片至少几厘米。

2 .根据制造商的说明设置蔬菜蒸锅并预热。

        警告：在操作过程中一定要监测蒸发情况并注意沸腾情况。不要让载玻片变干。

        注意：使用非密封容器，以便在煮沸过程中蒸发。

3 .将烧瓶中适当的抗原修复缓冲液预热至沸腾。

4 .将装有载玻片架的容器放入蒸锅中。

5.小心地将热缓冲液加入容器中，然后放载玻片架。如果方便的话，请在将容器放入蒸锅之前将缓冲液添加到容器中。

6.盖上蒸锅盖。缓冲液的容器也应该有一个封闭的盖子。

       提示：载玻片架最初会使抗原修复溶液的温度降低，但几分钟内就会恢复到95 - 100 °C 。

7 .此后将容器放入蒸锅中蒸20分钟。

8. 20分钟后，取出容器，用冷自来水冲洗10分钟。

        警告：小心热溶液。务必监测蒸发情况，并注意操作过程中是否沸腾。不要让载玻片变干。

        注意：使用非密封容器以便在煮沸过程中蒸发。

9.继续免疫组织化学染色方案。

第 2 阶段   酶促抗原修复

        酶修复有时会破坏切片的形态，因此需要测试浓度和处理时间。将酶溶液施加到组织上至少有两种方法：直接将溶液移至载玻片的组织上，或将组织载玻片架放入酶溶液容器中。第一种方法使用较少的试剂，但由于每张载玻片都需要单独处理，因此必须仔细监控孵育时间，以确保所有载玻片接受相同的处理。因此，将大批量载玻片浸入酶溶液容器中更容易处理。如果使用自动染色系统（例如 Ventana），请咨询制造商以获取适当的酶修复方案。

         使用的酶将在抗体数据表上注明。如果没有，胰蛋白酶可用于需要福尔马林/PFA固定后修复的多种抗原。

1）酶浸法

         请务必阅读您所选酶的制造商文献，因为某些酶需要特定的缓冲液和辅因子才能发挥作用。

所需材料

移液方法：材料和试剂

         - 37°C培养箱

         -加湿室（培养箱本身或带有湿纸巾的容器）

         -两个带载玻片架的TBS载玻片架容器

         -酶促抗原修复溶液（胰蛋白酶，见下文）

（1）胰蛋白酶储备液（0.5%蒸馏水）

         -胰蛋白酶50毫克

         -蒸馏水10毫升

         -混合溶解，储存于-20°C

（2）氯化钙储备液（1%）

         -氯化钙0.1克

         -蒸馏水10毫升

         -充分混合并储存于4°C

（3）胰蛋白酶工作液（0.05%）

         -胰蛋白酶储备液（0.5%）1 mL

         -氯化钙储备液1% 1 mL

         -蒸馏水8毫升

         -用1N NaOH将pH调节至7.8。4℃保存1个月，-20℃长期保存

实验步骤

1 .将水浴设置为您所使用的酶的最佳温度。

         1.1将超纯水加入两个可容纳载玻片架的容器中。

         1.2将容器放入水浴中加热。

         注意：使用足够量的水或缓冲液覆盖载玻片。

2 .对切片进行脱蜡和再水化。将载玻片放入一个水容器中进行加热。

         警告：将冷载玻片放入酶溶液中会降低溶液温度，降低酶活性并导致抗原位点修复不足。

3 .用另一个容器中的温水制备酶抗原修复缓冲液。然后，将容器放回水浴中，使溶液重新加热。

         警告：尽快制备酶抗原修复溶液，以避免损害酶的活性。

         提示：在放入载玻片之前让修复溶液恢复到温度。

4 .将加热的载玻片转移到酶溶液中10 - 20分钟，间歇性轻轻搅拌。此后，取出载玻片并将其放入自来水中3分钟以冲洗掉酶。

         注意：免疫组化染色前，应将组织切片在酶溶液中孵育10、15、20、25和30分钟，以优化修复时间。

5 .继续免疫组织化学染色方案。

2）酶移液法

所需材料

         - 37°C培养箱

         -加湿室（孵化器本身或带有湿纸巾的容器）

         -两个TBS载玻片架容器，带载玻片架

         -酶抗原修复溶液，请从以下相关溶液配方中选择：

                  （1）胰蛋白酶原液（0.5%蒸馏水）

                     -胰蛋白酶50毫克

                     -蒸馏水10毫升

                     -混合溶解，储存于-20ºC

                  （2）氯化钙原液（1%）

                     -氯化钙0.1克

                     -蒸馏水10毫升

                     -混合均匀并储存于4ºC

                  （3）胰蛋白酶工作液（0.05%）

                     -胰蛋白酶原液（0.5%）1 mL

                     -氯化钙原液1% 1 mL

                     -蒸馏水8毫升

                     -用 1N NaOH将pH值调节至7.8。在4ºC下储存一个月或在-20ºC下长期储存

实验步骤

1.制备胰蛋白酶溶液并预热至37°C。

         小心地吸干组织切片周围多余的水分，然后将酶溶液（通常50 - 100 μL就足够了）吸取到切片上。

         警告：可能需要用移液器尖头将溶液涂抹在切片周围；小心不要损坏组织。

2 .将载玻片放入加湿的容器中，然后放入37°C培养箱中。

         注意：避免将载玻片直接放在培养箱架上，因为温度变化可能会影响染色强度。理想情况下，装有载玻片的容器在培养箱中预热。

3 . 10 - 20分钟后，将载玻片从培养箱中取出并转移到盛有自来水的容器中的架子上，用自来水冲洗3分钟。

         注意：孵化时间需要优化。

4 .继续免疫组织化学染色方案。

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