Fura-2 AM 染色方法

       该实验方案已成功适应不同的细胞类型，包括成纤维细胞、PC12细胞和胚胎神经元，不同的细胞密度对应Fura-2 AM浓度各有不同。

阶段1   试剂制备

所需材料

       - Fura-2 AM

       - HBSS-1×（见下方配方）

       - 50mM KCl（见下方配方）

实验步骤

1.将Fura-2 AM与DMSO混合。

        • 将50 µL DMSO加入50 µg冻干的Fura-2 AM中，涡旋1分钟。

        • 提示：用箔纸包裹以避光，储存于-20℃。

2.配制Hank 's缓冲盐溶液10×（HBSS-10×）。

        2.1对于1000 mL，使用850 mL蒸馏水并添加下表中的试剂，搅拌。

        2.2最终体积定为1000 mL。

        2.3 4℃保存。

3.配制HBSS -1×溶液。

        3.1将100 mL 10×HBSS 溶液（上一步制备）与800 mL蒸馏水混合。

        3.2加入0.14 g无水CaCl2（分子量111，1.3 mM）、1g d-葡萄糖（分子量180.2，5.5 mM）和0.35 g NaHCO3（分子量84.01，4.2 mM）。

        3.3用蒸馏水定容至1000 mL，将pH值调至7.4，在4℃下保存约1周。

4.配制50mM KCl溶液。

        • 1升体积，pH值7.35，~290-310 mOsm。4℃保存。

第 2 阶段   重新接种

实验步骤

1.实验前一至两天，将细胞重新接种到置于35 mm组织培养皿中的胶原蛋白涂层盖玻片（圆形，玻璃，用乙醇灭菌，干燥）上。

2.将35 mm培养皿放入150 mm培养皿中，用作微型培养箱以及培养箱与实验之间的载体。

3.重新接种时，将细胞置于圆形玻璃盖玻片的中心以稳定下来，并确保成像达到最佳效果。

4.根据经验确定细胞密度以及如何重新接种，以使细胞在清洗和灌注溶液后粘附到玻璃上。

第 3 阶段   FURA-2 AM 成像

所需材料

       - Fura-2 AM

       -Ionomycin，游离酸

       - HBSS-1×

实验步骤

1.将 HBSS和50 mM KCl溶液从冰箱中取出，打开设备并进行校准曲线绘制。

       • 注意：检查细胞是否良好粘附在玻璃上。

2.取两个50 mL falcon管，分别标记为HBSS和HBSS+BSA。

       • 将HBSS从HBSS容器倒入标有HBSS的50 mL试管中。

3.配制HBSS+BSA溶液。

       3.1称量约45 mg BSA（无脂肪酸）并添加到标有HBSS+BSA的空管中。

       3.2将约45 mL HBSS转移到同一管中，轻轻混合，以免产生大量气泡，但要完全混合BSA，然后让其静置。

       3.3这应为1 mg/mL的BSA和HBSS混合物。

4.混合Fura-2和HBSS+BSA。

       4.1关闭室内灯，将Fura-2 AM 解冻于50 µl DMSO中，并混合。

       4.2每次仅装入2个35 mm培养皿，因为成像时间与Fura后清洗的时间不匹配。

       4.3将4-10 µL/35 mm培养皿中的Fura-2/HBSS/BSA混合物细胞吸入15 mL Falcon管中（用于成像的细胞中Fura-2 AM浓度较低会降低细胞内的缓冲能力）。

       4.4将4 mL HBSS+BSA加入含有Fura-2的15 mL管中。

       4.5从培养箱中取出两盘盖玻片，将其放在工作台上，然后将15 mL管高速涡旋1分钟。

       4.6将其放入装有2×50 mL HBSS和HBSS+BSA试管的架子中（松开/取下所有Falcon试管的盖子）。

• 提示：在附近放置一个废物容器，并打开并准备好无菌移液器吸头。

5.加入Fura。

       5.1从培养箱中取出2个35毫米培养皿。

       5.2使用1 mL无菌移液器吸头，从一个35毫米细胞培养皿中取出所有培养基并将其排入废液容器中。

       5.3使用相同的枪头，取出1 mL HBSS并轻轻添加到细胞中，小心沿着侧面放置并轻轻添加，以免破坏镀层细胞。

       5.4拉出相同的1 mL HBSS并将其喷射到废液容器中，用相同的尖端取出下一个1 mL HBSS并轻轻放在细胞上。

       5.5再次取出溶液并丢弃吸头。

       5.6使用新的无菌移液器吸头，吸取1 mL HBSS+BSA，轻轻清洗，去除废料。

       5.7使用相同的枪头，再重复两次，用HBSS + BSA清洗细胞3次。

       5.8使用同一枪头，立即加入1 mL已涡旋1分钟的 Fura+HBSS+BSA。

       5.9将第二份1 mL Fura-2 AM 添加到细胞中，并在盖玻片的盖子上标注时间。对第二个培养皿重复上述操作。

       5.10通常，上样时间为45分钟，但可能需要改变，以及将4-10 µL Fura-2 AM 放入2 mL HBSS+BSA中。将两个培养皿放回CO2/37℃培养箱中，上样时间为45分钟。

       • 提示：在附近放置一个废物容器，并打开并准备好无菌移液器吸头。

6.清洗细胞。

       6.1取出两个培养皿，用新的无菌枪头轻轻吸取1 mL Fura-HBSS + BSA混合物至废液中，然后再吸取第二份1 mL。

       6.2使用新的移液器吸头，每次用1 mL HBSS（不是HBSS+BSA）轻轻清洗细胞3-4次，然后将洗液放入废液中。

       6.3第4次洗涤后，保留1 mL HBSS，再加入第二个1 mL HBSS。标记时间并将其放回培养箱中培养30分钟至45分钟。

7.进行成像。

       7.1将第一个细胞盖玻片放入清洗器中约25分钟，然后将其放置在腔内的成像装置上。

       7.2最多在7-15分钟内进行成像实验，然后从培养箱中取出下一个培养皿。

       7.3在记录室中不断用HBSS灌注细胞，以进行静息Ca2+测量。使用某种刺激物去刺激细胞，这些刺激物可以是测试溶液，也可以是 50 mM KCl溶液，或者电刺激。

       7.4刺激细胞的过程中，会使用一系列高K+溶液（匹配的单价离子）：20 mM、40 mM和60 mM KCl溶液，每次用等量的KCl替换NaCl。

       7.5为了获得成像的阳性对照，使用20 µM工作浓度Ionomycin（5 mg游离酸在DMSO中混合至20 mM），在灌注时将适当体积放入腔室体积中。

       • 警告：所有实验都应在黑暗中完成。

8.为了继续这一天的实验，我们建议在清洗第一组细胞的同时开始加载接下来的两个盖玻片细胞。

       • 记录装载/清洗过程，了解切换盖玻片和进行成像所需的时间，以便您能够按时完成。

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