利用甲醇通透法进行流式细胞术

          流式细胞术是一种常用于分析细胞的表面和内部抗原的强大技术。在检测细胞内抗原时，通常需要对细胞进行固定和通透处理。甲醇通透法是一种常用的处理方法，通过使用冰冷的甲醇溶液，可以有效地固定细胞并破坏细胞膜，使抗体能够进入细胞内部结合目标抗原。这种方法适用于多种细胞类型，尤其是需要检测细胞核、线粒体等细胞器内部抗原的实验。

          甲醇通透法具有多个显著优势。比如，甲醇能够快速固定细胞，同时破坏细胞膜和核膜，使抗体更容易进入细胞内部。其次，甲醇处理后的细胞可以长期保存在-20℃，便于后续实验安排。此外，甲醇通透法适用于多种胞内抗原的检测，尤其是对于一些难以通过其他方法检测的磷酸化蛋白等修饰性抗原。然而，需要注意的是，甲醇可能会对某些抗原表位产生影响，因此在使用前需要进行小规模实验验证。

         通过甲醇通透法，研究人员可以高效地进行细胞内抗原的流式细胞术分析，同时保持细胞结构的完整性，为细胞生物学研究提供了有力支持。

实验操作

1. 收集细胞样品并固定

1.1将细胞培养至适当的生长阶段，并收集细胞，贴壁细胞需先用胰酶消化，制备单细胞悬液。

1.2离心，使单细胞沉淀在管底，弃去上清。

         注：离心条件需要根据细胞类型和试剂容量来确定。一般情况下，可设置150-300 g离心1-5 分钟。

1.3添加适量4%甲醛溶液重悬细胞，一般106细胞添加100 μl，充分吹打混匀，对细胞进行固定，室温放置15分钟。

1.4离心，弃去上清。

1.5用适量1× PBS重悬细胞，去除多余甲醛。

1.6离心，弃去上清，可用于后续透膜操作。

          注：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程期间，这类抗体将保持与目的靶标结合。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

2.细胞透膜

2.1添加90%冰冷的甲醇（100%的甲醇可用1× PBS稀释），重悬固定好的细胞。

2.2冰上孵育至少10分钟。

2.3离心，弃去上清。

2.4用足量的1× PBS洗涤细胞，离心，以去除甲醇。根据实际情况，有必要可重复清洗操作。

3. 免疫染色

3.1按照抗体推荐稀释度，制备一抗稀释液。

3.2用100 µl一抗稀释液重悬细胞，室温孵育1小时。

3.3用足量的1× PBS洗涤细胞，离心，弃去上清，重复1~2次。

3.4如果使用直标偶联抗体，可直接用200-500 µl 1× PBS重悬细胞，用于流式细胞仪上机分析。

         如果使用非偶联一抗，则提前配置荧光偶联的二抗稀释液。

3.5用100 µl二抗稀释液重悬细胞，室温孵育半小时。

3.6用足量的1× PBS洗涤细胞，离心，弃去上清，重复1~2次。

3.7用200-500 µl 1× PBS重悬细胞，用于流式细胞仪上机分析。

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