酶联免疫斑点技术（ELISPOT）实验方案

       酶联免疫斑点法（Enzyme-linked Immunospot, ELISPOT）是一种与ELISA相关的技术，用于检测分泌蛋白，例如细胞因子和生长因子。

        ELISPOT使用预涂有针对分泌蛋白特异性抗体的PVDF或硝酸纤维素膜96孔板。首先将细胞加入板中，细胞附着在包被的膜上。然后刺激细胞释放分泌蛋白，分泌蛋白与抗体结合。接下来，添加与固定蛋白特异性结合的检测抗体。

        产生的抗体复合物可通过酶促作用产生有色底物或使用荧光标记来检测。使用荧光的优点是能够一次识别多种分泌蛋白。

        可以通过手动计数斑点或使用专门设计的自动读数器来分析膜。每个分泌细胞都显示为一个颜色或荧光斑点，因此这是一种评估蛋白质分泌的定量方法。

一、孔板制备和一抗包被

所需材料

        - PVDF膜

        - 96孔板

        - 35%乙醇

        - PBS

        - 捕获抗体

        - 2%脱脂奶粉

实验步骤

1.将PVDF膜放入96孔板中，在35%乙醇中孵育30秒。

        注意：用PBS彻底清洗以确保乙醇完全去除。任何残留的乙醇都会影响细胞活力以及抗体的结合。

2.用磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释的捕获抗体包被96孔板。

        提示：为了形成明确的斑点，每孔应使用约0.5-1 µg的抗体。

3. 4°C孵育过夜。

4.清空孔中液体，轻拍干燥，并用PBS清洗。

        警告：此阶段请勿使用洗板机。

        注意：ELISPOT板比ELISA板更脆弱，应小心处理。拍干时动作要轻柔。

5.每孔添加100 µl 2%脱脂奶粉以阻断与膜的非特异性结合。将板在室温下孵育2小时。

6.用PBS清洗板3次并晾干。

        提示：如果需要，此时可以储存板子。将板子放入密封塑料袋中，加入干燥剂，在4°C下储存，储存时间不超过2周。

二、样品制备

        大多数ELISPOT实验都是用分离的PBMC（外周血单核细胞）进行的。新鲜制备的细胞和冷冻保存的细胞都可用于测定。但是，建议在解冻后让冷冻细胞静置至少一个小时，以便在加入细胞板之前清除细胞碎片。

        为保持细胞功能，应在采集血液样本8小时内制备和接种PBMC。如果血液样本放置超过此时间，与PBMC混合的粒细胞（中性粒细胞）可能会被激活。当使用FicollTM将PBMC与粒细胞分离时，这可能会改变它们的浮力曲线，因此粒细胞可能会污染PBMC层。活化的粒细胞也可能开始激活一些PBMC（它们可以下调CD3的信号转导zeta链，抑制T细胞功能）。

        如果无法在8小时内完成制备和包被：

        立即稀释血液样本。这有助于最大限度地减少粒细胞污染。例如，在RPMI或PBS中1:1稀释。保存于室温（不是4℃）。

        通过交联红细胞和粒细胞去除粒细胞，然后使用FicollTM将它们与PBMC分离。（缺点：可能会丢失一些PBMC）。市面上有用于此目的的试剂盒。

        在环境温度下运送新鲜样品。请注意，运输温度可能低于4℃。市面上有容器可供使用，可将样品保持在环境温度下。

        应优化样本的冷冻。尽可能使用无血清培养基（血清含有丝裂原和抑制剂，可能会影响结果）。

1，从新鲜血液样本制备 PBMC

        这里我们根据Ficoll-PaqueTM制造商的方案，通过密度梯度分离从新鲜血液中制备外周血单核细胞（PBMC）。

实验步骤

1.用等体积的无菌NaCl 0.9%或平衡盐溶液（如PBS或HBSS）稀释全血样本。

2.将稀释的样品铺在与初始血液量相等体积的Ficoll-Paque上。

        注意：小心减少样品和Ficoll-PaqueTM的混合。

3.室温下，关闭制动器，以2400 rpm的速度离心20分钟。

4.从Ficoll-Paque和血浆层之间的界面处取出PBMC。

5.用无菌NaCl 0.9％清洗富集的细胞，先离心两次，每次5分钟，2000 rpm，然后以3000 rpm的速度离心8秒，以去除血小板。

6.调整培养基中推荐的细胞密度，以适应随后的ELISPOT程序。

7.可选——冷冻细胞以供储存。

        （1）在细胞培养基中添加20％DMSO。置于冰上。

        （2）给冷冻小瓶贴上标签。

        （3）将细胞以40×106细胞/mL的密度重悬于冰冷的培养基中，置于冰上。

        （4）将0.5 mL细胞悬浮液分装到冷冻管中。

        （5）将 20% DMSO以1:1的比例轻轻加入细胞悬浮液中。最终悬浮液浓度为20×106细胞/毫升。

        （6）立即将冷冻管放入冷冻容器中。

        警告：快速冷冻会损害细胞。

        提示：为了检查结果的标准化，请保存来自优质捐赠者的大量冷冻细胞样本，以用作一系列ELISPOT实验的对照。

2，解冻冷冻细胞以进行ELISPOT检测

实验步骤

1 .使用37 ℃水浴或烧杯温水快速解冻细胞。

        警告：任何时候都不要涡旋细胞。

2.将细胞轻轻转移到含有15 mL培养基的50 mL管中。每50 mL管使用0.5至5.0 mL细胞。

3.将培养基注入试管，至体积为50 mL。轻轻颠倒管子以混合。

4.以1200 rpm的速度旋转细胞5分钟。

5.倒出上清液并轻轻弹动试管以重新悬浮沉淀。在适当的培养基中计数并调整细胞至所需密度，随即可用于ELISPOT检测。

3，准备小鼠脾脏样本

实验步骤

1.组织均质化。

        1.1用无菌不锈钢轻轻梳理组织，并将其分散到30 mL推荐培养基中。

        1.2此外，通过轻轻地上下吹打几次来分散团块。

        1.3清除剩余的细胞团和碎片。

2.以2000 rpm的速度离心细胞5分钟，然后将细胞沉淀重新悬浮在建议用于以下步骤的培养基中。

        提示：如果用适当的刺激物预先刺激脾细胞24-48小时以释放细胞因子，然后再将其加入到ELISPOT板中，并用相同的补充剂进一步孵育8-16小时以形成斑点，则可以获得一致的结果。

三、细胞孵育

实验步骤

1 .使用上一阶段制备的PBMCs。利用台盼蓝等活力染料对细胞进行计数。活力细胞应超过95%。

2.将细胞稀释至所需浓度并将细胞悬浮液加入孔中。

        提示：如果要优化细胞数量，请使用1:2稀释系列。不要摇动培养皿。

        应优化每孔细胞数量。例如，如果预计分泌目标细胞因子的细胞百分比较低，则使用更多细胞。请参阅特定目标试剂盒方案，了解有关检测对照和每孔细胞数量的建议。通常，细胞数量应介于每孔2×105至4×105 个PBMC细胞之间。

        如果可能的话，使用无血清培养基，因为血清中含有许多蛋白质，可能会影响结果。或者，可以测试几批血清，以找到具有最佳响应噪声比的血清。然后可以存储该批次并用于后续实验。

3 .于37°C二氧化碳培养箱中培养过夜。请勿摇动培养皿。

        提示：在过夜孵育期间，细胞会分泌细胞因子，该细胞因子会与一抗结合。

        如果细胞需要时间来对刺激作出反应，请参阅下面的间接方法。

        警告：如果您有多个细胞板，请不要堆叠它们，以防止产生边缘效应。

        注意：细胞培养时不要移动培养皿。这将导致出现不清晰的“蜗牛痕迹”斑点。

4 .间接ELISPOT（可选）

        如果细胞需要一些时间才能对刺激作出反应，则可能需要在单独的96孔培养皿中用刺激物进行预处理，然后再转移到ELISPOT板。

阳性对照刺激

        使用ELISPOT检测细胞因子的实验需要使用阳性对照。在这些阳性对照孔中，应使用已知可诱导所检测细胞因子表达的药剂刺激细胞。然后可将其与阴性对照（未处理或刺激不同的分泌蛋白）进行比较。

        典型的刺激包括：

        - LPS刺激IL - 1β、IL - 6分泌

        - PMA和离子霉素刺激IL - 2 , IL - 4的分泌

        - PHA，10 µg/mL，用于IFN-γ

        - 针对IFNγ、IL - 4、IL - 10 和Granzyme B的抗CD3/CD28抗体

        提示：确保您使用正确的刺激物刺激 PBMCs，以检测您的目标细胞因子。

5.用PBS 0.1％ Tween 20孵育10分钟，洗去细胞和未结合的细胞因子。

        警告：此阶段请勿使用洗板机。

        注意：确保在洗涤缓冲液中加入Tween 20。一些细胞在培养过夜后会开始附着（例如一些干细胞）。Tween 20将有助于将这些细胞从膜上洗掉。

四、与检测抗体一起孵育

所需材料

        - 偶联的检测抗体

        - 含0.1％Tween 20的PBS

实验步骤

1.将偶联的检测抗体稀释于含 1% BSA的PBS中。

2.将偶联的检测抗体加入孔中，室温下孵育1 - 2小时。

        注意：孵育时间可能需要优化。

3.用含0.1％Tween 20的PBS清洗板3次，以去除非特异性检测抗体结合。

五、 酶促检测

实验步骤

1.将酶底物溶液加入到每个孔中。

        对于酶检测方案，应将基底从板底部取下，以便在添加底物/发色团之前彻底清洗膜。

        例如，与链霉亲和素碱性磷酸酶结合物孵育后，除去基底并在流动的蒸馏水下清洗膜的两侧。这有助于防止高背景，因为一些试剂可能会通过膜泄漏到板的底部托盘中。

2.更换基座并添加底物后，仔细监测斑点的形成情况。

3.一旦反应速度减慢，则用含0.1％Tween 20的PBS轻轻清洗平板以停止反应。

4.将基底从板上取下，并用蒸馏水清洗膜的两侧，以阻止斑点形成。

5.擦干培养板并让膜在室温下干燥。随后便可上机检测和分析。

        注意：如果将膜在4°C下储存过夜，斑点可能会变得更清晰，并且可能会持续改善长达2周。如果储存，请用箔纸包裹膜并将其保存在4°C下。

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