CUT&RUN-seq实验方案

        核酸酶靶向切割和释放（Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease，CUT&RUN）实验技术是一种新兴的、用于研究蛋白质与DNA相互作用的染色质分析方法，它通过使用抗体特异性地标记目标蛋白，再利用结合在抗体上的核酸酶（如pAG-MNase）切割与这些蛋白相互作用的DNA片段，进而通过免疫沉淀技术纯化这些DNA片段并进行测序分析，从而精确定位蛋白质在基因组上的结合位点。

        ChIP和CUT&RUN都是用于研究蛋白质与DNA相互作用的技术，但它们在DNA片段化的方法和实验流程上有所不同。ChIP通常依赖于物理方法（如超声波）对固定细胞的染色质进行随机片段化，而CUT&RUN则利用抗体引导的核酸酶直接在活细胞或轻微固定的细胞中切割目标蛋白附近的DNA，从而实现更精确的DNA片段定位和较低的背景噪声。

        相对于ChIP技术，CUT&RUN提供了一种更为精确和高效的染色质-蛋白互作分析方法，它能够减少非特异性结合并提高实验的信号-噪声比。

第 1 阶段   细胞采集和磁珠准备

实验步骤

1.每个抗体/微球菌核酸酶（MNase）反应收集5,000至100,000个细胞，如果需要设置input，需为input 样品额外收集5,000至100,000个细胞。确保包括用于阳性对照和阴性对照的反应。

        注： 对于贴壁细胞系，首先需要使用胰蛋白酶消化细胞，并用至少3体积的培养基中和。为保证细胞的完整形态，不建议从培养皿中刮取细胞。

2.血细胞计数器或其他细胞计数器对细胞进行计数，取每个反应所需的细胞数。对于HeLa细胞，每次反应使用2.5×105个。

3.每1 ml细胞悬液添加2.7 µl 37%甲醛，以达到0.1%甲醛的最终浓度。旋转混匀并置于室温下孵育2分钟。

4.每1 ml固定细胞悬液添加100 µl甘氨酸溶液（10×）以停止交联。旋转混匀并置于室温下孵育5分钟。

5.将细胞悬液在4°C下以3,000 × g的速度离心3分钟并除去液体，立即进入下一步。或者，固定的细胞沉淀可以在使用前储存在-80°C下长达6个月。

        注：当总细胞数< 100,000时，离心后的细胞颗粒肉眼观察可能并不明显，因此很容易在洗涤步骤中丢失细胞。因此，当处理低细胞数时，我们建议跳过下面的洗涤步骤。

6.配置洗涤缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.5 mM亚精胺），使用前添加蛋白酶抑制剂混合物（如P665818）。

7.向细胞中添加1 mL洗涤缓冲液，以600 × g的速度旋转细胞3分钟，除去上清液并重复清洗1-3次（视细胞数量来定，如果细胞沉淀肉眼不可见，可减少洗涤次数）。

        注意：对于input样品，此时可添加100 µl 1× 洗涤缓冲液，并轻轻上下摇晃移液管来重悬细胞沉淀物。并将100 µl细胞转移到一个新管中，并在4°C下储存，作为input样本。

8.配置结合缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、10 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MnCl2），在磁力架上用1 mL结合缓冲液清洗ConA磁珠，再用结合缓冲液重悬磁珠，制备ConA磁珠浆。每个反应需10 µL磁珠。

        注意：重悬磁珠时，避免涡旋ConA珠悬浮液，因为反复涡旋可能会从磁珠中置换出伴刀豆球蛋白A。

9.在室温下将细胞和磁珠混合20分钟，每4分钟轻轻混合一次，让细胞与活化的磁珠结合。

10.将管放在磁力架上1-2分钟，直到溶液变澄清，弃去上清液并保留磁珠，从而将细胞结合的磁珠从溶液中分离出来。

第 2 阶段   抗体结合

所需材料

        - 洗涤缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、150 mM NaCl、0.5 mM 亚精胺、蛋白酶抑制剂混合物）

        - 0.5 M EDTA 原液

        - 5% Digitonin原液

        - 抗体缓冲液（参见步骤 1）

        - 已验证用于CUT&RUN的抗体

        - 卧式回转摇床

        - 磁力架

实验步骤

1.制备抗体缓冲液。取适量洗涤缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物），添加EDTA和Digitonin储备液，使最终浓度达到0.2 mM EDTA和0.05% Digitonin。

2.用抗体缓冲液重悬磁珠。如果在同一管中准备多个反应，则每个反应重新悬浮约100 µL，然后分装到单独的管中。

3.根据抗体推荐的稀释度，将抗体添加到磁珠混合物中，4°C下，于水平振荡器中孵育过夜，注意防止ConA珠变干。

第 3 阶段   pAG-MNase结合

所需材料

        - pAG-MNase

        - 洗涤缓冲液（20 mM HEPES、150 mM NaCl、0.5 mM亚精胺、蛋白酶抑制剂混合物）

        - 5% Digitonin原液

        - Digitonin洗涤缓冲液（含0.05% Digitonin）

        - 卧式回转摇床

        - 磁力架

实验步骤

1.将管放在磁力架上1-2分钟，直到溶液变澄清，弃去上清液并保留磁珠，将细胞结合的磁珠从溶液中分离出来。

2.在洗涤缓冲液中（含蛋白酶抑制剂混合物）稀释洋地黄皂苷原液，制备Digitonin洗涤缓冲液，Digitonin的最终浓度为0.05%。

3.向每个反应添加200 µL Digitonin洗涤缓冲液清洗磁珠，将管子放在磁力架上 1 分钟，直到溶液澄清，弃去上清液并保留磁珠。重复清洗一次。

4.用50 µL Digitonin洗涤缓冲液重悬磁珠，添加pAG-MNase至终浓度为700 ng/μL，将磁珠与pAG-MNase溶液一起置于水平摇床上，130 rpm，室温下孵育1-2小时。

第 4 阶段   DNA消化

所需材料

- 低盐缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5、0.05% Digitonin、0.5 mM亚精胺）

- 孵育缓冲液（3.5 mM HEPES pH 7.5、10 mM CaCl2、0.05% Digitonin）

- 磁力架

实验步骤

1.将管放在磁力架上1-2分钟，直到溶液变澄清，弃去上清液并保留磁珠，将细胞结合的磁珠从溶液中分离出来。

2.配置低盐缓冲液和孵育缓冲液，使用前添加Digitonin。配制好后将缓冲液放在冰上。

3.向每个反应添加200 µL Digitonin洗涤缓冲液，孵育5分钟，将管子放在磁力架上静置1分钟，直到溶液变澄清，弃去上清液并保留磁珠。重复清洗一次。

4.用低盐缓冲液清洗磁珠。向每个反应添加200 µL 低盐缓冲液，孵育5分钟，将管子放在磁力架上静置1分钟，直到溶液变澄清，弃去上清液并保留磁珠。

5.添加100 µL孵育缓冲液，在冰上孵育15分钟以消化染色质，孵育过程中不时地进行混合。将管子放在磁力架上静置1分钟，直至溶液澄清，弃去上清液并保留磁珠。

第 5 阶段   DNA 洗脱和测序

所需材料

        - 终止缓冲液（20 mM EGTA、170 mM NaCl、0.05% Digitonin、50 µg/mL RNAse A、25 µg/mL糖原）

        - 热混合器

        - 磁力架

实验步骤

1.添加100 µL冰冷的终止缓冲液，和磁珠一起放入热混合器中，以700 rpm的速度摇动，在37°C下孵育30分钟，以停止反应并将消化的DNA片段释放到溶液中。

2.将管子放在磁力架上静置1分钟，直至溶液澄清，收集上清转移到新管中，此时的上清液含有DNA片段。

3.使用商业试剂盒提取DNA并准备测序。

4.将DNA片段送去测序。

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