使用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞

1. 概述:

        氯化钙法是一种经典的实验室技术，用于制备大肠杆菌感受态细胞，使其能够通过转化吸收外源DNA。该方法涉及用含有氯化钙的溶液处理细胞，从而增强细菌细胞壁对DNA的通透性。

2. 材料:

        • 大肠杆菌菌株: 常用的菌株包括DH5α、XL1-Blue或Top10，用于转化实验。

        • LB培养基: 用于培养大肠杆菌。

        • 氯化钙 (CaCl₂) 溶液 (0.1M): 新鲜制备并保持在冰上。

        • 无菌甘油 (10% v/v): 用于存储感受态细胞。

        • 无菌蒸馏水: 用于洗涤细胞。

        • 冰冻的无菌移液器吸头和管子: 用于处理细胞。

3. 实验步骤:

       步骤 1: 接种和培养

       • 用单个大肠杆菌菌落接种5 mL的LB培养基，在37°C下振荡培养过夜 (200-250 rpm)。

       步骤 2: 扩展培养

       • 将1 mL过夜培养物转移至100 mL新鲜LB培养基中，使用500 mL烧瓶。

       • 在37°C下振荡培养，直至OD600达到0.4-0.6（对数生长期中期），通常需要2-3小时。

       步骤 3: 细胞收获

       • 将培养物在冰上冷却15-30分钟以减缓细胞代谢活动。

       • 将培养物转移至无菌、预冷的离心管中。

       • 在4°C下以4,000 rpm离心10分钟，收集细胞沉淀。

       步骤 4: 洗涤细胞

       • 小心地弃去上清液，不要扰动细胞沉淀。

       • 使用移液器将细胞沉淀缓慢重悬于20 mL冰冷的0.1M CaCl₂溶液中。

       • 在冰上孵育30分钟。

       • 再次在4°C下以4,000 rpm离心10分钟，弃去上清液。

       步骤 5: 制备感受态细胞

       • 将细胞沉淀重悬于10 mL冰冷的0.1M CaCl₂溶液中。

       • 在冰上进一步孵育30分钟，以增强感受态。

       • 可选步骤: 添加无菌10%甘油，使最终浓度达到10%，以便长期存储。

       步骤 6: 分装与存储

       • 将感受态细胞悬液分装至无菌、预冷的微量离心管中（通常每管50-100 µL）。

       • 在液氮或干冰/乙醇浴中快速冷冻分装后的细胞。

       • 将感受态细胞存储于-80°C以便长期使用。

4. 质量控制:

       • 转化效率: 通过已知质粒（如pUC19）转化感受态细胞并在选择性培养基上培养菌落，以检测细胞的感受态。通过计算菌落数来评估转化效率。

       • 活性检测: 在感受态制备步骤前后，分别取少量细胞进行平板涂布，确保细胞保持活性。

5. 注意事项:

       • 温度敏感性: 在整个过程中保持所有溶液和材料处于冰冷状态，以最大化感受态细胞的转化效率。

       • 甘油添加: 如果感受态细胞需长期存储，建议添加甘油。

       • 无菌操作: 确保所有步骤在无菌条件下进行，以避免污染。

        这种方法提供了一种可靠的方式，制备适用于DNA转化实验的大肠杆菌感受态细胞。阿拉丁提供高质量的感受态制备相关的生化试剂，并拥有广泛覆盖的生物学产品，助力高质量实验结果的产出。

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