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蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳实验方案 （BN-PAGE）
蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（Blue native polyacrylamide gel electrophoresis, BN-PAGE） 是一种用于分离和分析大型蛋白质复合物的电泳技术。它通过使用温和的去污剂和带负电荷的染料（如Coomassie Blue G-250）处理样品，使蛋白质复合物在非变性条件下保持其天然状态。
在电泳过程中，这些复合物根据其大小和与染料的结合程度被分离，从而能够在凝胶中清晰地观察到不同蛋白质复合物的分布。BN-PAGE特别适用于研究膜蛋白和需要保持活性的蛋白质组装体，因为它能够在不破坏其结构的情况下进行分离。
BN-PAGE技术因其能够提供高分辨率的蛋白质复合物分离而受到青睐，它不仅能够用于基础研究中的蛋白质复合物分析，还能用于生物制药领域中蛋白质药物的质量控制。通过BN-PAGE，研究人员可以更好地理解蛋白质之间的相互作用以及它们在细胞内的功能。
所需试剂和设备：
- 经BN-PAGE验证的一抗
- 合适的偶联二抗
- 电泳和蛋白质印迹试剂
- 10%月桂基麦芽糖苷溶液（正十二烷基-β-D-麦芽糖苷）
- 考马斯亮蓝G（如B104241）
- 垂直丙烯酰胺电泳装置
- 电印迹装置-完全浸没
- pH计、天平等标准实验室设备
缓冲液配方：
磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）：
- 1.4 mM磷酸二氢钾
- 8 mM Na2HPO4
- 140 mM氯化钠
- 2.7 mM KCl，pH 7.3
蛋白酶抑制剂储存液（每个为1000×）：
- 1 M 苯甲烷磺酰氟（PMSF）丙酮溶液
- 1 mg/mL胃酶抑素
第一向电泳阴极缓冲液：
- 50 mM Tricine
- 15 mM Bis-Tris
- 0.02%考马斯亮蓝G
调节pH值至7.0
第一向电泳阳极缓冲液：
- 50 mM Bis-Tris
调节pH值至7.0
第二向电泳缓冲液：
- 25 mM Tris
- 192 mM甘氨酸
- 0.1% 十二烷基硫酸钠
SDS-PAGE变性缓冲液：
- 10%甘油
- 2%十二烷基硫酸钠
- 50 mM Tris，pH 6.8
- 0.002% 溴酚蓝
- 50 mM 二硫苏糖醇DTT
Tris/甘氨酸或Towbin电印迹转印缓冲液：
- 25 mM Tris
- 192 mM甘氨酸
- 10%甲醇
- 0.1%十二烷基硫酸钠
膜清洗缓冲液：
- PBS加0.05% Tween 20
膜封闭缓冲液：
- PBS加5%脱脂奶粉
碱性磷酸酶显色缓冲液：
- 0.1 M二乙醇胺（DEA）
- 5 mM MgCl2
- 100× NBT原液，溶于100% DMF，浓度为50 mg/mL
- 100× BCIP原液，溶于70% DMF，浓度为 50 mg/mL
缓冲液 A：
- 0.75 M 6-氨基己酸，50 mM Bis-Tris/HCl，pH 7.0
- 1 µg/mL 亮肽素
- 1 µg/mL 胃酶抑素
- 1 mM PMSF
- 亮肽素储存液：1 mg/mL（水）
- 胃酶抑素储存液：1 mg/mL（乙醇）
- PMSF储存液 ：0.3 M（乙醇）
- LM：正十二烷基-β-D-麦芽糖苷
第一阶段 样品制备
本文BN-PAGE实验操作基本按照Schägger和von Jagow（1991）所述进行。
首先，溶解的样品用带电（考马斯亮蓝）染料染色。然后根据染料结合量（与它们的大小成正比）通过电泳分离完整的线粒体复合物。这种第一向凝胶可以立即进行蛋白质印迹，或者，在将凝胶浸泡在变性SDS缓冲液中后，可以在第二向中进一步分离已分离复合物的蛋白质成分。
整个组织或细胞提取物作为样本时，往往信号较弱，所以建议进行BN-PAGE时，提前从细胞中分离线粒体。
实验步骤
1.将0.4 mg线粒体沉淀悬浮于pH 7.0、含40 µL 0.75 M氨基己酸的50 mM Bis-Tris中。
2.加入7.5 µL 10% 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷。混匀并在冰上孵育30分钟。
3.72,000 xg离心30分钟。
提示：建议使用台式超速离心机，如果没有的话，也可以使用台式微量离心机的最大速度（通常约为16,000 xg）进行离心。
4.收集上清液并弃去沉淀。
5.将2.5 µL 5% 考马斯亮蓝G溶液/悬浮液（溶于0.5 M 氨基己酸）加入到上清液中。
6.添加蛋白酶抑制剂（例如1 mM PMSF、1 µg/mL 亮肽素和1 µg/mL胃酶抑素，参见缓冲液配方）。
第 2 阶段 天然丙烯酰胺凝胶的制备及第一向电泳
天然丙烯酰胺凝胶可以手动倒出。虽然可以使用单一丙烯酰胺浓度，例如10%凝胶，但通常更建议使用线性丙烯酰胺浓度，例如6-13%。
实验步骤
1 .用手工或机器灌注天然丙烯酰胺凝胶。
当使用双室梯度形成器时，将这些天然丙烯酰胺凝胶倒入10-gel BioRad Mini-PROTEAN II 多路灌注室的配方详述如下，推荐的丙烯酰胺- BioRad 30％丙烯酰胺/Bis溶液（37.5:1）。
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2.倒入后，用50%异丙醇溶液覆盖凝胶。
3.当所有10块凝胶都凝固后，倒掉异丙醇，用水冲洗并取出凝胶。
4 .使用浓缩凝胶和梳子。
5 mL 浓缩胶配方：
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5.将5-20 µL的样品装入孔中。设置合适的电泳条件，样品应在150 V约2小时或直到样品缓冲液蓝色染料几乎从凝胶底部流出。
第 3 阶段 第二向电泳
第一向电泳获得的凝胶可以进行蛋白质印迹分析，如果需要用抗体检测分离的线粒体复合物，可以直接挑过此步骤，进入下一环节。
如果希望线粒体复合物可以在第二向（变性）进一步分解为其蛋白质亚基，可以按照此步骤操作，然后进行电印迹。
实验步骤
1 .从一向凝胶中切下每个凝胶泳道并浸泡在SDS变性缓冲液中。
2.将每个泳道旋转90°，然后加载到SDS-PAGE 10-20%丙烯酰胺凝胶的顶部。
提示：该凝胶应该更宽以容纳第一向凝胶条。
第 4 阶段 电印迹和免疫检测
电印迹应使用完全浸没的系统进行，例如BioRad Mini Trans-blot系统。我们建议使用 Tris-Glycine转移法对BN-PAGE凝胶进行印迹（详见缓冲液部分）。另外，建议优先考虑使用PVDF膜（如 Immobilon），而不是硝酸纤维素。此外，改变电印迹电流和持续时间可能会提高某些蛋白质的分辨率和转移量。
实验步骤
1.电泳后，应将凝胶浸泡在转移缓冲液中30分钟，然后组装转移夹层。
2.电印迹应在150 mAmp下进行1.5小时。蓝色染料从凝胶完全转移到膜上表明电泳转移良好。
3.膜应在5%牛奶/PBS溶液中封闭至少3小时，或者4°C下封闭过夜。
4.用PBS 0.05% Tween 20 清洗膜10分钟。
5.用含1%牛奶/PBS溶液按照推荐比例稀释一抗，将膜与BN-PAGE单克隆抗体一起孵育。一般5 mL抗体溶液足以覆盖100 cm2膜，建议放在摇床不断摇动。
注意：应按照数据表提供的推荐浓度使用一抗。但是，当使用低样品量或特别是在分析替代物种作为材料来源时，可能需要进行一些优化（通常增加一抗的浓度）。
6.用 PBS 0.05% Tween 20溶液清洗膜两次，每次5分钟。
7.用含1%牛奶/BSA的PBS溶液根据推荐浓度稀释二抗，将膜与二抗一起孵育，二抗应根据所选的检测方法进行偶联物的选择。
注意：此溶液或后续溶液中加入叠氮化钠作为防腐剂，会抑制辣根过氧化物酶结合抗体的活性。
二抗也各不相同，应针对您的系统进行优化。通常，酶联二抗稀释度为1:1000-10,000倍是正常的。
强烈推荐的两种方法是碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶偶联的二抗。
8.用PBS 0.05% Tween 20溶液清洗膜两次，每次5分钟。
9.用PBS冲洗印迹膜以除去可能抑制检测的Tween 20。
第 5 阶段 印迹显影
● 碱性磷酸酶偶联二抗
实验步骤
1.将膜放入含有 1% v/v BCIP 和 1% v/v NBT的AP显色缓冲液中孵育。
2 .显影直至获得满意的信号。
3.用水冲洗印迹以终止显影。
● 辣根过氧化物酶偶联二抗
实验步骤
1.将膜放入HRP显色液（通常推荐ECL系统，其中溶液为40:1试剂 A:B）中孵育2分钟。
2 .用透明保鲜膜覆盖膜，并在适当的暗室条件下暴露于 X 射线胶片并进行胶片显影。
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Categories: 实验方案（Protocols）