细胞凋亡DNA片段化分析实验方案

        凋亡细胞的DNA会在caspase激活的核酸酶（CAD）作用下被切割成约200个碱基对的片段，形成DNA梯状结构（DNA ladders）。通过检测细胞凋亡过程中DNA片段化现象，可以评估细胞凋亡的程度。

        本实验采用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA片段化，如果需要更快速或定量的分析，可以考虑使用TUNEL试剂盒进行流式细胞术或显微镜分析。

阶段1   细胞收集与裂解

1.收集细胞样本，用PBS洗涤一次，去除培养基。

2.在每份细胞样本中加入0.5 mL裂解缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4；5 mM EDTA；0.2% Triton X-100）。

3.涡旋震荡，然后将样本置于冰上孵育30分钟，以充分裂解细胞。

4.将裂解后的样本在4℃下以27,000 × g离心30分钟。收集上清液，将其分为两份，每份250 µL。

5.向每份上清液中加入50 µL冰冷的5 M NaCl，并轻轻涡旋混合。

阶段2   DNA提取和纯化

1.向每份样本中加入600 µL乙醇和150 µL 3 M醋酸钠（pH 5.2），轻轻混匀。

将样本置于-80℃孵育1小时。

2.以20,000 × g离心20分钟，小心弃去上清液。

3.将DNA提取物合并，用400 µL提取缓冲液（10 mM Tris，5 mM EDTA）重悬沉淀。

4. 向合并的DNA提取物中加入2 µL 10 mg/mL DNase-free RNase，在37℃孵育5小时，充分去除RNA。

5.加入25 µL 20 mg/mL蛋白酶K和40 µL缓冲液（100 mM Tris，pH 8.0；100 mM EDTA；250 mM NaCl），在65℃孵育过夜，去除蛋白成分。

6. 使用酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）抽提DNA，去除上层水相。然后用乙醇沉淀DNA，小心弃去上清液。

        注意：这时候的DNA沉淀比较松散，去除上清的时候切记不要扰动沉淀部分。

7.将DNA沉淀在室温下风干。

阶段3   DNA琼脂糖凝胶电泳

1.用20 µL TAE缓冲液重悬DNA沉淀，并添加2 µL样本缓冲液（含0.25%溴酚蓝、30%甘油）。

2.配置2%琼脂糖凝胶（含1 µg/mL溴化乙锭）。

3.进行电泳分离DNA。

4.使用紫外透射仪观察DNA梯状结构，拍照记录结果。在琼脂糖凝胶电泳图中，出现约200 bp的DNA梯状结构表明细胞发生凋亡。

        阴性对照：未诱导凋亡的细胞样本应无明显DNA梯状结构。

        阳性对照：可使用已知诱导凋亡的试剂（如H2O2）处理细胞作为阳性对照。

注意事项

●  操作环境：整个实验过程需在低温下进行，以防止DNA降解。

●  试剂选择：确保所有试剂和耗材均为RNase-free和DNase-free。

●  样本处理：样本处理需轻柔，避免剧烈震荡，以免影响DNA完整性。

●  电泳条件：根据DNA片段大小调整电泳时间和电压，通常为100 V，30-60分钟。

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