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蛋白酶抑制剂
蛋白酶在细胞内广泛存在，是蛋白质降解和稳态调控的重要因子。然而，在生物化学和分子生物学实验中，样品在裂解或纯化过程中容易被内源性蛋白酶降解，导致目标蛋白丢失或功能受损。为避免这种情况，研究人员通常在裂解液中加入蛋白酶抑制剂，以维持样品完整性。
一、蛋白酶抑制剂的分类
由于蛋白酶种类繁多，目前尚无“广谱万能”抑制剂，通常需要根据样品特性选择多种抑制剂联合使用。常见抑制剂按照作用对象可分为以下几类：
1.丝氨酸蛋白酶抑制剂
作用对象：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶等。
代表性抑制剂：
- PMSF：经典抑制剂，抑制效率高，但水溶液中极不稳定（半衰期约30分钟），需临用前加入。
- AEBSF：水溶性好，稳定性和安全性优于PMSF。
- Aprotinin：小分子蛋白质，可逆抑制多种丝氨酸蛋白酶。
名称 | 货号 | 级别和纯度 |
PMSF溶液 | 100mM in ethanol | |
苯甲基磺酰氟(PMSF) | Moligand™, ≥98%(GC) | |
PMSF溶液 | 10mM in DMSO | |
4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF) | 10mM in DMSO | |
AEBSF溶液 | 50mg/ml in H2O | |
AEBSF溶液 | 10mg/ml in H2O | |
4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF） | ≥98% | |
重组抑肽酶 | EnzymoPure™, 10mM in Water | |
抑肽酶 牛 | 重组, ≥98%(SDS-PAGE), expressed in Nicotiana(tobacco),≥5 TIU/mg protein | |
抑肽酶 来源于牛肺 | UltraBio™, ≥98%(SDS-PAGE), 3-8 TIU/mg solid | |
抑肽酶 | EnzymoPure™, 高级纯 | |
重组抑肽酶 | EnzymoPure™, ≥3 EPU/mg | |
抑肽酶 来源于牛肺 | EnzymoPure™, 3-8 TIU/mg |
2.半胱氨酸蛋白酶抑制剂
作用对象：组织蛋白酶（Cathepsin B, L）。
代表性抑制剂：
- E64：高效、特异、不可逆，稳定性好。
- Leupeptin：可逆抑制剂，同时对部分丝氨酸蛋白酶也有效。
图一 E-64化学结构式
名称 | 货号 | 级别和纯度 |
E-64 | 10mM in DMSO | |
E-64,半胱氨酸蛋白酶抑制剂 | Moligand™, ≥99%, protease inhibitor | |
亮肽素 | EnzymoPure™, 10mM in DMSO | |
亮肽素 | UltraBio™, ≥95%(HPLC), microbial | |
亮肽素 | Moligand™, ≥90%(HPLC) | |
亮肽素 | 超纯级, EnzymoPure™ |
3.天冬氨酸蛋白酶抑制剂
作用对象：胃蛋白酶、CathepsinD、肾素。
代表性抑制剂：
- Pepstatin A：特异性强，有效浓度低，但溶解性差，通常以甲醇/乙醇配制。
名称 | 货号 | 级别和纯度 |
胃蛋白酶抑制剂 | Moligand™, ≥75%(HPLC) | |
胃蛋白酶抑制剂 | 10mM in DMSO | |
胃蛋白酶抑制剂 A TFA | ≥97% |
4.金属蛋白酶抑制剂
作用对象：胶原酶、嗜热菌蛋白酶及其他Zn²⁺依赖性蛋白酶。
代表性抑制剂：
- EDTA/EGTA：通过螯合金属离子发挥作用，广谱且常用。
- 1,10-邻菲罗啉：同样通过螯合金属离子抑制酶活性。
图二 EGTA化学结构式
名称 | 货号 | 级别和纯度 |
乙二胺四乙酸二钠盐浓缩液 | 稀释成1升使用，稀释后的浓度为0.1M | |
乙二胺四乙酸二钠盐浓缩液 | 稀释成1升使用，稀释后的浓度为0.01M | |
乙二胺四乙酸 二钠盐 二水合物 | UltraBio™, 超纯级, ≥98.5% | |
3,6-二氧杂-1,8-辛二胺四乙酸（EGTA） | AR, ≥99% | |
3,6-二氧杂-1,8-辛二胺四乙酸（EGTA） | 用于分子生物学, ≥99% | |
1,10-菲罗啉 一水合物 | 10mM in DMSO | |
1,10-菲罗啉 一水合物 | ACS, ≥99% | |
1,10-菲罗啉 一水合物 | AR, ≥98% |
5.氨基肽酶抑制剂
作用对象：从肽链N端逐步水解的蛋白酶。
代表性抑制剂：
- Bestatin：对氨基肽酶B、亮氨酸氨基肽酶有效。
- EDTA：对金属依赖型氨基肽酶也可发挥作用。
名称 | 货号 | 级别和纯度 |
乌苯美司盐酸盐 | ≥98%(HPLC) |
6.蛋白酶体抑制剂
作用对象：26S蛋白酶体复合物。
代表性抑制剂：
- MG132：可逆抑制剂，常用于研究泛素-蛋白酶体通路。
- Lactacystin：不可逆、特异性强。
图三 MG-132化学结构式
名称 | 货号 | 级别和纯度 |
MG-132 | 10mM in DMSO | |
MG-132,可逆蛋白酶体抑制剂 | Moligand™, ≥98% | |
乳胞素 | BioReagent, ≥95% |
二、使用策略
1.复合使用原则
组织和细胞样品中往往含有多种蛋白酶，因此建议使用抑制剂混合物而非单一抑制剂，以实现广谱保护。
2.获取方式
- 商业化预混抑制剂：常见形式为片剂或即用型溶液，配比经过优化，使用方便，适合常规实验。
- 自行配制：需根据实验目标选择抑制剂组合，以下为哺乳动物细胞/组织蛋白提取的基础配方（工作浓度，仅供参考）
抑制剂 | 工作浓度 | 靶标蛋白酶类型 | 储备液配制（溶剂） | 储存条件 | 货号 |
PMSF | 1 mM | 丝氨酸蛋白酶 | 100 mM（乙醇/异丙醇） | -20℃，避光 | |
抑肽酶 | 0.31 μM | 丝氨酸蛋白酶 | 1 mg/mL（去离子水） | -20℃，分装 | |
亮抑蛋白酶 | 0.5 μg/mL | 半胱氨酸+丝氨酸蛋白酶 | 1 mg/mL（去离子水） | -20℃，分装 | |
胃蛋白酶抑制剂 A | 1 μM | 天冬氨酸蛋白酶 | 1 mg/mL（甲醇/乙醇） | -20℃，避光 | |
EDTA | 0.5 mM | 金属蛋白酶 | 0.5 M（去离子水，调pH 至 8.0） | 室温 |
注意：PMSF必须在使用前新鲜加入，储备液应分装并在–20°C保存。
三、实验注意事项
1.低温操作：所有步骤应在冰上进行，降低蛋白酶活性。
2.提前添加：抑制剂需在裂解液使用前加入，保证样品即时保护。
3.浓度控制：避免过量使用，以免影响后续实验（如免疫沉淀、功能分析）。
4.稳定性差异：部分抑制剂（如PMSF）需快速使用，避免失效。
5.特殊需求：若研究磷酸化蛋白，还需额外加入磷酸酶抑制剂（如NaF、β-甘油磷酸、Na₃VO₄）。
6.安全操作：多种抑制剂具有毒性，应在通风橱中操作并佩戴防护装备。
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